Теломераза: методы определения активности Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

Аннотация научной статьи по нанотехнологиям, автор научной работы — Скворцов Д. А., Зверева М. Э., Шпанченко О. В., Донцова О. А.

Укорачивание концов хромосом (теломер), обусловленное полуконсервативным механизмом репликации ДНК, определяет возможное число делений клетки, играя роль «клеточных часов». Теломераза удлиняет одну из цепей теломеры, компенсируя ее укорачивание, поэтому теломеразная активность служит маркером пролиферативной активности клеток. В подавляющем большинстве нормальных клеток человека теломераза неактивна, в отличие от эмбриональных тканей, стволовых клеток и репродуктивных органов. Теломераза активируется в большинстве злокачественных опухолей, что можно использовать для диагностики неопластической трансформации. Поэтому разработка методов определения теломеразной активности привлекает внимание исследователей. Тестирование теломеразной активности необходимо при поиске ингибиторов теломеразы потенциальных противоопухолевых средств. Кроме того, активация теломеразы может играть положительную роль при регенерации тканей, к примеру, после частичного удаления печени или инфаркта миокарда. Все методы определения активности теломеразы можно разделить на две большие группы: методы, основанные на прямом определении синтезированной теломеразой ДНК, и методы, использующие различные схемы усиления сигнала от ДНК, созданной теломеразой . Рассмотренные в представленном обзоре методы пригодны для тестирования теломеразной активности в клетках простейших, отдельных клетках клеточных линий, смешанных клеточных популяциях и тканях.

Похожие темы научных работ по нанотехнологиям , автор научной работы — Скворцов Д. А., Зверева М. Э., Шпанченко О. В., Донцова О. А.

Текст научной работы на тему «Теломераза: методы определения активности»

Теломераза: методы определения активности

Д. А. Скворцов*, М. Э. Зверева, О. В. Шпанченко, О. А. Донцова

Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ *E-mail: skvorratd@mail.ru Поступила в редакцию 02.11.2010 г.

РЕФЕРАТ Укорачивание концов хромосом (теломер), обусловленное полуконсервативным механизмом репликации ДНК, определяет возможное число делений клетки, играя роль «клеточных часов». Теломераза удлиняет одну из цепей теломеры, компенсируя ее укорачивание, поэтому теломеразная активность служит маркером пролиферативной активности клеток. В подавляющем большинстве нормальных клеток человека теломераза неактивна, в отличие от эмбриональных тканей, стволовых клеток и репродуктивных органов. Теломераза активируется в большинстве злокачественных опухолей, что можно использовать для диагностики неопластической трансформации. Поэтому разработка методов определения теломераз-ной активности привлекает внимание исследователей. Тестирование теломеразной активности необходимо при поиске ингибиторов теломеразы - потенциальных противоопухолевых средств. Кроме того, активация теломеразы может играть положительную роль при регенерации тканей, к примеру, после частичного удаления печени или инфаркта миокарда.

Все методы определения активности теломеразы можно разделить на две большие группы: методы, основанные на прямом определении синтезированной теломеразой ДНК, и методы, использующие различные схемы усиления сигнала от ДНК, созданной теломеразой. Рассмотренные в представленном обзоре методы пригодны для тестирования теломеразной активности в клетках простейших, отдельных клетках клеточных линий, смешанных клеточных популяциях и тканях.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА теломераза, методы определения активности, онкодиагностика, физико-химические методы, определение ДНК.

что такое теломераза и зачем определять ее активность

В 1961 г. Хейфлик и Мурхиад показали, что культура соматических клеток имеет ограниченный период жизни (предел Хейфлика) [1]. В 1973 г. Олов-ников предположил, что возможное число делений клетки определяется укорачиванием концов хромосом - теломер [2], играющих роль «клеточных часов». Теломеры защищают геном клетки от деградации, участвуют в мейотическом спаривании хромосом и регуляции транскрипции генов прителомерной области [3, 4]. В клетках, способных размножаться бесконечно (бессмертных), существует механизм, компенсирующий укорачивание теломер. В 1985 г. Блекберн и Грейдер открыли теломеразу - фермент, удлиняющий одну из цепей теломеры [5].

Теломераза представляет собой РНК-белковый комплекс, основные компоненты которого - РНК-матрица для синтеза теломер (ТЕИС), выполняющая также структурную функцию, и обратная транскриптаза (ТЕИТ) [6]. Теломеразный комплекс

(теломераза) связывается с теломерой или олигонуклеотидом, последовательность которого может не совпадать с теломерной последовательностью (теломеримитирующий олигонуклеотид), и синтезирует короткий фрагмент ДНК (GТТAGG у млекопитающих). Затем теломераза передвигается на конец теломеры (транслокация) и вновь синтезирует фрагмент ДНК (рис. 1). Активность теломеразы пропорциональна общему количеству синтезированной ею ДНК, а процессивность пропорциональна длине синтезированных фрагментов.

Теломеразная активность служит маркером пролиферативной активности клеток. Компоненты теломеразы могут выполнять функции, не зависящие от сборки активного комплекса. Например, hТЕRТ (ТЕИТ человека) независимо от присутствия hТЕRC (ТЕИС человека) может работать как РНК-зависимая РНК-полимераза [7]. Повышение экспрессии hТЕRC не всегда совпадает с появлением теломеразной активности [8]. hТЕRC ингибирует протеинкиназу АТИ, мишенями которой являются

Связывание с теломерой/олигонуклеотидом

Теломера или олигонуклеотид .TTAGGGTTAGGGTTAG

Диссоциация с теломеры/олигонуклеотида

Рис. 1. Общая схема работы теломеразного комплекса.

известный супрессор опухолевого роста p53 и про-теинкиназа контрольных точек CHK1, входящая в систему проведения сигналов от поврежденной ДНК. Снижение уровня hTERC приводит к остановке клеточного цикла в фазах G1 и G2 в результате активации белка p53 и протеинкиназы CHK1, но механизм этого остается неизвестным [9].

Активность теломеразы не выявляется в подавляющем большинстве нормальных клеток человека, но присутствует в репродуктивных органах и эмбриональных тканях. Этот фермент активен в стволовых клетках и некоторых быстро обновля-

ющихся тканях, например в эпителии кишечника, но в этом случае активность теломеразы, как правило, ниже, чем в опухолевых клетках (рис. 2). Те-ломеразная активность более характерна для злокачественных опухолей, в доброкачественных опухолях ее активность и частота обнаружения заметно ниже [lO]. Определение теломеразной активности используется как для диагностики опухолей, так и для поиска потенциальных противоопухолевых средств - ингибиторов теломеразы. Кроме того, теломераза участвует в регенерации тканей после частичного удаления печени и инфаркта миокар-

Рис. 2. Зависимость длины теломер от числа делений в различных типах клеток: эмбриональных клеточных линиях, соматических клетках и трансфицированных hTERT клетках. А - достижение клетками предела Хейфлика; Б -кризис, сопровождающийся гибелью клеток и перерождением уцелевших в опухолевые;

В - трансфекция клеток геном hTERT.

Таблица 1. Некоторые олигонуклеотиды, используемые в различных модификациях TRAP

да. Роль теломеразы в старении в связи с работой теломер как «клеточных часов» также привлекает внимание.

методы с амплификацией синтезированной

ТЕЛОМЕРАзОЙ ДНК (TRAP)

Среди методов определения активности теломера-зы наиболее распространен TRAP (протокол амплификации теломерных повторов) [11], позволяющий, благодаря некоторым модификациям, проводить полуколичественный и количественный анализ. Существуют модификации, при которых повышается скорость анализа, радиоактивная метка заменяется немечеными соединениями, снижается количество побочных продуктов и т.д., например, методы сцин-

тилляционного анализа сближения, гибридизаци-онной защиты, транскрипционной амплификации, экстракции магнитными шариками [12]. Некоторые модификации дают возможность определять активность теломеразы даже в одной клетке [13].

Протокол амплификации теломерных повторов можно разбить на три основных этапа: удлинение праймера, амплификация синтезированной тело-меразой ДНК и детекция. На стадии удлинения теломерные повторы добавляются теломеразой, присутствующей в клеточном экстракте, к теломе-римитирующему олигонуклеотиду (TS, см. табл. 1). После этого проводят ПЦР-амплификацию синтезированной теломеразой ДНК с использованием специфических праймеров (теломеримитирующего и обратного). На этом этапе в синтезированную те-ломеразой ДНК могут включаться различные метки: радиоактивная, флуоресцентная, аффинная. Затем следует детекция (в оригинальном методе с электрофоретическим разделением продуктов ПЦР и фотографированием) (рис. 3).

Исходный метод TRAP не свободен от ряда недостатков. При амплификации продуктов ПЦР первоначально применяли олигонуклеотид CX, имевший комплементарное перекрывание в несколько олигонуклеотидов с TS. Это приводило к образованию димеров праймеров и продуктов, возникающих из-за взаимодействия между праймерами. Даже при использовании оптимального праймера ACX

Олиго- нуклеотид Нуклеотидная последовательность

Рис. 3. Схема протокола амплификации теломерных повторов (TRAP).

с некомплементарным TS-концом при анализе концентрированных экстрактов опухолевых тканей может появляться фоновый сигнал [14]. Другая проблема состоит в том, что если использовать обратные праймеры, полностью соответствующие теломерным повторам, то праймеры отжигаются в ходе ПЦР не по краям матрицы (в силу периодичности теломер) и появляются ложные сигналы. Эту проблему решают, добавляя на края праймера дополнительные некомплементарные теломерам участки (табл. 1) с 5’-концевым нетеломерным «довеском» из 6 нуклеотидов. Может использоваться комбинация нескольких праймеров, используемых в качестве обратных, для уменьшения неспецифических сигналов (подробнее о двухпраймерной системе далее, праймеры RP и RPC3 приведены в табл. 1). В смесь TRAP для оценки влияния стабилизирующих квадруплексы ингибиторов может добавляться олигонуклеотид TSG4 (табл. 1), который не требует синтеза теломеразой нескольких повторов до начала действия ингибитора [15]. Более подробно преимущества и недостатки различных олигонуклеотидов, используемых в TRAP, рассмотрены в работе [12]. Кроме того, если использовать ПЦР для амплификации сигнала, то на результат определения теломе-разной активности могут влиять ингибиторы ПЦР, содержащиеся в образце.

Первоначально в методе TRAP продукты ПЦР выявляли в полиакриламидном геле (ПААГ) по радиоактивной метке, которую вводили с помощью радиоактивно меченного праймера или встраивали в ДНК в ходе реакции. Метод позволяет качественно оценивать активность и процессивность теломеразы в экстрактах клеток и тканей, но, как уже сказано, нуждается в радиоактивных препаратах.

ПЦР второй стадии TRAP позволяет получить достаточно ДНК для окрашивания в геле, например бромидом этидия [16] (достаточно сильный мутаген, чувствительность невысокая), нитритом серебра [17] (чувствительность, как при использовании радиоактивной метки, но метод более трудоемкий и сравнительно дорогой), Sybr Green [18] и его аналогами (чувствительность, как при использовании радиоактивной метки [19], а мутагенность гораздо ниже, чем у бромида этидия, хотя он также является интеркалирующим красителем). Возможно также и флуоресцентное ме-чение олигонуклеотидов, используемых в TRAP [20].

Очистка синтезированной теломеразой ДНК и эффективность TRAP

Получить экстракты опухолевых клеток или клеточных линий и определить в них теломеразную активность достаточно просто, тогда как ткани состоят из нескольких типов клеток и могут содержать ве-

щества, влияющие на количественную и даже качественную оценку теломеразной активности. Поэтому возможны ложноположительные или ложноотрицательные результаты, которые могут повлиять на правильность диагноза и прогноз заболевания. Определение теломеразной активности могут затруднять и особенности биопсийных образцов: большие объемы жидкости (кровь и т.д.) или присутствие многочисленных нормальных клеток. В этих случаях возможна экстракция синтезированной теломеразой ДНК при помощи модифицированных магнитных шариков. При этой процедуре ингибиторы ПЦР удаляются или сильно разбавляются. Метод TRAP с такой экстракцией состоит из трех основных этапов: удлинение субстратимитирующего олигонуклеотида теломе-разой, выделение синтезированной теломеразой ДНК с помощью модифицированных магнитных шариков, амплификация. На этапе экстракции синтезированную теломеразой ДНК гибридизуют с С-богатым био-тинилированным праймером (CCCTAA)2 и выделяют ее из реакционной смеси с помощью покрытых стреп-тавидином магнитных шариков. Затем синтезированную теломеразой ДНК высвобождают из комплекса с помощью нагревания и проводят ПЦР. Эта модификация имеет на порядок меньшую чувствительность к ингибиторам ПЦР по сравнению со стандартным TRAP и несколько большую эффективность при анализе тканевых и других комплексных образцов [21]. Вместо биотинилированного праймера и магнитных шариков можно использовать экстракцию фенолом и хлороформом [16], хотя при этом хуже удаляются примеси, хорошо растворимые в воде, а не в органических растворителях.

Внутренние стандарты TRAP

Учесть возможное присутствие в образцах ингибиторов Taq-полимеразы (например, гемсодержащих соединений) и осуществить общий контроль ПЦР позволяют внутренние стандарты (амплифицируе-мые с теми же праймерами, что и синтезированная теломеразой ДНК), которые также могут служить для нормирования количества синтезированной те-ломеразой ДНК. Наиболее распространены два стандарта - длиной 36 и 150 п.н. Стандарт 36 п.н. избыточно амплифицируется, если образцы имеют низкую теломеразную активность, конкурируя с синтезированной теломеразой ДНК и давая ложноотрицательный сигнал [18]. Стандарт 150 п.н. более чувствителен к присутствию ингибиторов Taq-полимеразы в реакционной смеси. Стандарты можно использовать в TRAP с ПЦР в реальном времени с праймерами, флуоресцентная метка которых отличается от метки в праймерах для амплификации синтезированной теломеразой ДНК [22].

1. Удлинение праймера MTS теломеразой

П 2. Связывание обратного праймера RP3g

V в первых двух циклах

Я 3. Синтез ДНК в первых двух циклах

4. Связывание RP-праймера в циклах 3-29

5. Синтез ДНК в циклах 3-29

Рис. 4. Схема «двухпраймерного» TRAP [23, 24].

TRAP с праймерами с резонансным переносом энергии (FRET)

Один из вариантов окрашивания ДНК в методе TRAP - использование праймеров с энергопереносом (амплифлуоров). Амплифлуоры имеют уникальную шпилечную структуру, содержащую донор (флуоресцеин) и акцептор (4’-диметиламинофенил-азобензойная кислота). Флуоресценция появляется только в случае встраивания праймера в продукты ПЦР, т.е. отпадает необходимость в применении радиоизотопов и резко сокращается объем проводимого после ПЦР-анализа. Замена амплифлуора-ми субстрата теломеразы и обратного праймера позволяет добиться достаточно высокой интенсивности флуоресцентного сигнала. Праймеры, используемые для амплификации внутренних стандартов, должны иметь донорно-акцепторную пару с иной длиной волны флуоресценции, чем праймеры, используемые для амплификации синтезированной теломеразой ДНК [22].

Метод с использованием резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением (HTRF) сочетает стандартную технику FRET и флуо-рофоры с длительным временем затухания флуорес-

TRAP с дополнительным специфичным обратным праймером («двухпраймерный»)

«Двухпраймерный» TRAP - это модификация стандартного TRAP, предназначенная для уменьшения ложных сигналов (рис. 4).

В этом варианте TRAP отсутствует электрофоретический анализ продуктов ПЦР. В нем оценивается суммарная радиоактивность как критерий теломеразной активности. Синтезированная тело-меразой ДНК амплифицируется с использованием двух обратных праймеров, длиной 20 (RP) и 38 нуклеотидов (RPC3) (табл. 1), в присутствии [3H]TTP или [a-32P]dCTP, при этом длинного праймера добавляют в 50 раз меньше, чем короткого. После ПЦР двухцепочечную ДНК отделяют осаждением и фильтрацией. Преимущество этого метода состоит в том, что благодаря низкой концентрации праймера RPC3 уменьшается количество продуктов взаимодействия между праймерами, а присутствие стандартных количеств праймера RP обеспечивает значительную степень амплификации синтезированной теломера-зой ДНК [23, 24]. Метод позволяет качественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.

Амплификация в присутствии меченного криптатом европия аналога дезоксиуридин утрифосфата

Связанный с авидином флуорофор

Рис. 5. Схема метода TRAP с использованием резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением [26]. F - флуорофор, а - авидин, b - биотин, K - меченный криптатом европия аналог дезоксиуридинтрифосфата.

Амплифицированные биотинилированные 3Н-меченные продукты теломеразы

Покрытые стрептави-дином флуоромикро-сферы, содержащие сцинтиллятор, излучающий в присутствии трития

Связывание Детекция излучения на сцинтилляторе

Рис. 6. Схема детекции в TRAP с помощью сцинтилля-ционного анализа сближения.

продукты теломеразы Акридин -меченный

ценции. Метод основан на использовании криптатных комплексов европия или тербия. Данные лантаноиды обладают длительным периодом затухания флуоресценции, а комплексообразование с макроциклически-ми соединениями с образованием криптатных комплексов дополнительно увеличивает их стабильность [25]. Меченный криптатом европия аналог дезоксиури-динтрифосфата использовали для оценки количества ДНК в TRAP с биотинилированным олигонуклеотидом TS. После добавления конъюгата аллофикоцианин-стрептавидин ДНК в TRAP дает сигнал FRET [26] (рис. 5). Метод позволяет полуколичественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.

TRAP с детекцией с помощью сцинтилляционного анализа сближения

Еще один вариант детекции амплифицированной в TRAP ДНК без ПААГ - сцинтилляционный анализ сближения. Использованный вместе с традиционным TRAP, он позволяет увеличить скорость анализа те-ломеразной активности. Субстратом в этом методе служат 5’-биотинилированные олигонуклеотиды, а амплификация происходит в присутствии [3H]TTP. Биотинилированная 3Н-меченная ДНК связывается с покрытыми стрептавидином флуоромикросферами, содержащими сцинтиллятор, излучающий в присутствии трития (рис. 6). Таким образом, вместо разделения ДНК в геле с последующей фотодетекцией выход продуктов ПЦР оценивают на сцинтилляционном счетчике, что позволяет сократить время анализа после ПЦР до 1 ч и полуколичественно определить

Рис. 7. Схема детекции в TRAP с детекцией методом «защиты гибридизацией».

активность теломеразы в больших сериях экстрактов тканей и клеточных линий. Чувствительность данного метода ограничена примерно 10 клетками. Основной недостаток метода - использование трития, кроме того, как и большинство методов детекции продуктов TRAP без ПААГ, он чувствителен к артефактам ПЦР [27].

TRAP с детекцией методом «защиты гибридизацией»

Более безопасной является модификация TRAP, в которой используется метод «защиты гибридизацией» (Hybridization protection assay-TRAP). В этом методе для детекции ДНК после амплификации применяют зонды, меченные ковалентно связанным акридином [28] (рис. 7). Эта же схема детекции используется в транскрипционной схеме амплификации теломеразных повторов. Метод позволяет полуколичественно определять активность теломе-разы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.

TRAP в сочетании с иммуноферментным анализом (ИФА)

В методе TRAP-ИФА ДНК после амплификации определяют колориметрически, что позволяет качественно и полуколичественно оценивать теломе-разную активность. Биотинилирование TS-праймера дает возможность связывать амплифицированную ДНК с покрытыми стрептавидином микропланшета-

продукты реакции _

т Связывание дигоксигенин-меченного зонда

Связывание с покрытыми стрептавидином * титрационными микропланшетами

Связывание конъюгата т антител к DIG и фермента

Рис. 8. Схема иммуноферментного определения продуктов ПЦР при TRAP-анализе (или продуктов теломе-разной реакции при прямом ИФА).

ми (рис. 8). Амплифицированная ДНК денатурирует, гибридизуется с меченными дигоксигенином (DIG) зондами, специфичными к теломерным повторам, и связывается с микропланшетами за счет взаимодействия стрептавидин-биотин. Этот комплекс выявляется с помощью поликлональных антител овцы к DIG, конъюгированных с пероксидазой хрена, активность которой определяют колориметрически [29, 30]. От гибридизационного варианта TRAP этот метод отличается появлением второго шага усиления сигнала за счет ферментативной реакции.

К недостаткам TRAP-ИФА можно отнести сложности с разделением теломераза-положительных и теломераза-отрицательных контролей, которые могут возникнуть из-за отсутствия внутренних кон-тролей и двух шагов усиления сигнала. Тем не менее метод TRAP-ИФА более быстрый по сравнению с TRAP, основанным на разделении амплифициро-ванной ДНК в геле, что позволяет использовать его в скрининговых исследованиях. Метод пригоден для полуколичественного определения активности теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.

делять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии. Метод не имеет особых преимуществ перед другими методами, в которых не используют гель-электрофорез и радиоактивное мечение, но при этом достаточно трудоемок.

TRAP с ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени используют для одновременной амплификации ДНК и измерения количества продуктов, получаемых после каждого цикла амплификации. Стандартный TRAP в комбинации с ПЦР в реальном времени позволяет получать количественные результаты [32, 33]. Этот метод применим для изучения ингибиторов теломеразы и анализа больших серий образцов [12]. Сравнение с традиционным TRAP показывает, что без оценки количества продуктов ПЦР в реальном времени возможно завышение теломеразной активности и сглаживание небольших различий в активности из-за насыщения ПЦР-реакции на последних циклах. Кроме того, дополнительную проблему представляет возможность образования димеров праймеров и появление вследствие этого ложноположительного сигнала. Остроту этой проблемы можно снизить, если использовать обратный праймер с «якорем», мешающим образованию димеров, уменьшить количество праймеров и число циклов, в результате чего праймер-димеры образуются преимущественно на поздних циклах программы (35-39 циклов), в то время как в стандартном TRAP таких циклов 28. Эта проблема уменьшается и при измерении флуоресценции в ранней экспоненциальной фазе ПЦР [32]. Метод позволяет количественно определять активность теломера-зы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10-50 клеток теломераза-положительной клеточной линии.

Как и стандартный TRAP с гель-электрофорезом, TRAP с ПЦР в реальном времени имеет несколько вариантов детекции. Например, использование зондов, специфичных к амплифицированной в ПЦР синтезированной теломеразой ДНК, флуоресцирующих лишь в составе дуплекса, в противном случае эти зонды образуют нефлуоресцирующую шпилечную структуру [34].

TRAP с электрохимической детекцией

После ПЦР в TRAP можно отделить непрореагировавшие нуклеотидтрифосфаты, а затем обработать оставшиеся продукты 3 М HCl. В рассматриваемом методе электрохимически определяют dGMP, один из продуктов полного гидролиза амплифицированной ДНК [31]. Метод позволяет полуколичественно опре-

TRAP на микрочипах

Метод TRAP на микрочипах представляет собой сочетание двухпраймерного TRAP и связывания продуктов ПЦР на чипах с последующей гибридизацией зондов и детекцией. Для определения синтезированной теломеразой ДНК и внутреннего стандарта используют разные флуоресцентные метки: Cy3

для амплифицируемой синтезированной теломера-зой ДНК и Cy5 - для стандарта. К достоинствам этого метода можно отнести высокую скорость детекции синтезированной теломеразой ДНК при поточном анализе и повышенную специфичность за счет использования соответствующих зондов [35]. Метод позволяет полуколичественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.

Теломеразную активность анализируют, как правило, в клеточном экстракте. Если клеточные линии однородные, то результат отражает активность те-ломеразы в клетках. Если же изучают экстракты образцов опухолевых тканей, то иногда имеет смысл рассматривать лишь сам факт наличия или отсутствия теломеразной активности, поскольку содержание опухолевых клеток в таких образцах варьирует от 3 до 90% и более. В этом случае результаты ничего не говорят об уровне теломеразной активности в клетках разного типа, составляющих ткань, а также о различиях между опухолевыми и нормальными клетками одной ткани (например, повышение активности теломеразы в крови связано с появлением активированных лейкоцитов или перерождением каких-то клеток крови). Чтобы преодолеть этот недостаток создан in situ TRAP, в котором используют FITC-меченные прямой и обратный праймеры [36]. В этом методе образцы в виде взвеси клеток иммобилизуют на покрытые силаном стекла и сушат холодным воздухом. Затем на каждый образец наносят реакционную смесь для TRAP, инкубируют, теломеразу инактивируют нагреванием, добавляют обратный праймер с полимеразой и проводят ПЦР in situ. По окончании реакции стекла анализируют на флуоресцентном микроскопе, типы клеток определяют с помощью окрашивания. По интенсивности флуоресценции и ее локализации (ядро/цитоплазма) определяют активность теломеразы в отдельных типах клеток в смеси. В уро- и бронхиальных смывах высокая теломеразная активность проявляется яркой флуоресценцией ядер злокачественных, но не доброкачественных клеток [37, 38]. Сравнение со стандартно окрашенными препаратами указывает на связь флуоресценции в ядре со злокачественными клетками, в то время как сигнал от цитоплазмы обнаруживается в гранулоцитах и макрофагах [39]. Сходная корреляция найдена при анализе плеврального выпота [40]. Более того, in situ TRAP успешно применяли не только к образцам клеточных суспензий, но и на срезах тканей, в частности для диагностики рака печени [41]. Метод позволяет полуколичествен-

но определять активность теломеразы и ее локализацию в отдельных клетках тканей и клеточных суспензий.

Транскрипционная амплификация синтезированной теломеразой ДНК

Для увеличения количества синтезированной тело-меразой ДНК вместо ПЦР используют транскрипционную амплификацию. В комбинации с «защитой гибридизацией» этот метод позволяет измерять активность теломеразы всего за 4 ч. Праймер, служащий субстратом для теломеразы, содержит не только теломеримитирующую последовательность, но и сайт посадки Т7-РНК-полимеразы. Синтезированная теломеразой ДНК служит субстратом для гибридизации обратного праймера, содержащего дополнительную последовательность, не комплементарную теломерным повторам, за счет которой обратный праймер присоединяется к концу синтезированной теломеразой ДНК, и на следующем этапе происходит достройка двухцепочечной ДНК. Используя эту ДНК как матрицу, Т7-РНК-полимераза синтезирует РНК, по которой обратная транскриптаза синтезирует новую цепь ДНК. После этого РНК удаляется РНКазой, а по одноцепочечной ДНК с помощью прямого праймера достраивается вторая цепь ДНК (рис. 9).

С помощью этой схемы можно за 75 мин при 40° С амплифицировать синтезированную теломеразой ДНК в количествах, сопоставимых с ПЦР. Последующие реакции могут проводиться в той же пробирке, что и амплификация. Чувствительность метода позволяет выявлять теломеразную активность в образцах из 1-1000 клеток. Метод чувствителен к присутствию РНКаз [12, 42]. Основное преимущество метода перед TRAP с ПЦР-амплификацией - отсутствие прогревания образца при амплификации и игнорирование специфических ингибиторов Taq-полимеразы. Метод позволяет полуколичественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода -экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.

прямая детекция синтезированной теломеразой ДНК

Детекция теломеразной активности с помощью прямого включения радиоактивно меченного субстрата

Метод основан на способности теломеразы удлинять олигонуклеотиды в присутствии dNTP. Если олигонуклеотид или один из dNTP (как правило dGTP, так как синтезируемые теломеразой теломеры обогащены остатками гуанина) содержит радиоактивную метку, то по ее включению в ДНК можно элек-

Рис. 9. Схема детекции те-ломеразной активности с заменой ПЦР-амплификации теломераз-ных продуктов на транскрипционную амплификацию [12, 42].