Оздоровление малины от вируса кустистой карликовости (rbdv) методом комплексной терапии в культуре in vitro Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»
Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Антонова О.Ю., Дунаева С.Е., Ухатова Ю.В., Камылина Н.Ю., Долганова Н.А.
Изучено влияние различных методов терапии на эффективность оздоровления от вируса кустистой карликовости малины ( RBDV ) в культуре in vitro. Растения 41 селекционного сорта малины из коллекции ВИР (каждый сорт был представлен полевым растением и его in vitro аналогом) протестированы на присутствие RBDV методом ИФА. В полевой коллекции RBDV выявлен у 17 сортов (41,5%), у 8 из них вирусом были поражены также in vitro клоны. Для оздоровления отобрали микрорастения 7 сортов: Dormanred, Ottawa, Бальзам, Высокая, Новокитаевская, Самарская Плотная, Спутница. Терапию проводили в четырех вариантах: химиотерапия на среде с рибавирином (30 мг/л) или РНКазой (0,01%) и комплексная терапия, совмещающая химиотерапию теми же реагентами с обработкой повышенной температурой (35°С). Для всех сортов отмечено угнетение роста и развития растений на средах с рибавирином, по сравнению со средами с РНКазой. Повышенная температура также приводила к угнетению растений и снижению их жизнеспособности. Сочетание термотерапии с обработкой рибавирином вызывало гибель почти половины микрорастений. Наиболее термостойкими оказались сорта Dormanred, Новокитаевская и Самарская Плотная. Выжившие клоны (от 2 до 22 для каждого сорта, всего 49) повторно протестировали методом ИФА. Практически все свободные от RBDV растения были получены посредством комплексной терапии. При этом использование рибавирина давало лучшие результаты, по сравнению с РНКазой (соответственно 60 и 25% оздоровленных клонов). Химиотерапия без термообработки оказалась недостаточно эффективна, этим методом удалось оздоровить только 1 растение на среде с РНКазой.
Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Антонова О.Ю., Дунаева С.Е., Ухатова Ю.В., Камылина Н.Ю., Долганова Н.А.
In vitro improvement of raspberry varieties from raspberry bushy dwarf virus (RBDV) using complex therapy method
The effect of different antiviral therapy methods on the efficiency of in vitro eradication of raspberry bushy dwarf virus ( RBDV ) was studied. Raspberry plants of 41 selection varieties from VIR collection was tested for RBDV presence by ELISA. Every variety was presented by field plant and its in vitro analogue. RBDV was detected in 17 varieties from field collection (41.5 %), for 8 of them RBDV was also detected in in vitro plants. We selected microplants of 7 varieties for improvement: Dormanred, Ottawa, Balzam, Vysokaya, Novokitaevskaya, Samarskaya Plotnaya, Sputnitsa. The treatment was carried out using four strategies: chemotherapy on a media with ribavirin (30 mg/L) or with RNase (0.01 %) and a complex therapy which combined the chemotherapy by the same agents and the heat treatment (35deg C). The inhibition of growth and development of microplants of all varieties was observed on the media with ribavirin in compare with that on the media with RNase. The heat treatment also led to inhibition of plants and reduction in their viability. The combination of thermo-therapy with treatment by ribavirin caused the loss almost of half of microplants. Varieties Dormanred, Novokitaevskaya and Samarskaya Plotnaya were the most heat-resistant. Survived clones (from 2 to 22 for each variety, 49 clones in total) were re-tested by ELISA. In the most cases RBDV-free plants were obtained by the complex therapy. The use of ribavirin showed the better results in comparison with RNase (60 % and 25 % of eradicated clones respectively). Chemotherapy without heat treatment was not sufficiently effective; only one eradicated plant was obtained by this method.
Текст научной работы на тему «Оздоровление малины от вируса кустистой карликовости (rbdv) методом комплексной терапии в культуре in vitro»
УДК632.9:632.38: 634.711: 632.934.3: 632.935.11:573.6.086.83
оздоровление малины от вируса кустистой карликовости (rbdv) методом комплексной терапии в культуре in vitro
О.Ю. АНТОНОВА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
С.Е.ДУНАЕВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Ю.В. УХАТОВА, младший научный сотрудник Н.Ю. КАМЫЛИНА, младший научный сотрудник Н.А. ДОЛГАНОВА, научный сотрудник О.В. ЛИСИЦЫНА, лаборант-исследователь Т.А. ГАВРИЛЕНКО, доктор биологических наук, зав. отделом
Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова, ул. Большая Морская, 42-44, Санкт-Петербург, 190000, Россия E-mail: olgaant326@mail.ru
Резюме. Изучено влияние различных методов терапии на эффективность оздоровления от вируса кустистой карликовости малины (RBDV) в культуре in vitro. Растения 41 селекционного сорта малины из коллекции ВИР (каждый сорт был представлен полевым растением и его in vitro аналогом) протестированы на присутствие RBDV методом ИФА. В полевой коллекции RBDV выявлен у 17 сортов (41,5%), у 8 из них вирусом были поражены также in vitro клоны. Для оздоровления отобрали микрорастения 7 сортов: Dormanred, Ottawa, Бальзам, Высокая, Новокитаев-ская, Самарская Плотная, Спутница. Терапию проводили в четырех вариантах: химиотерапия на среде с рибавирином (30 мг/л) или РНКазой (0,01%) и комплексная терапия, совмещающая химиотерапию теми же реагентами с обработкой повышенной температурой (35°С). Для всех сортов отмечено угнетение роста и развития растений на средах с рибавирином, по сравнению со средами с РНКазой. Повышенная температура также приводила к угнетению растений и снижению их жизнеспособности. Сочетание термотерапии с обработкой рибавирином вызывало гибель почти половины микрорастений. Наиболее термостойкими оказались сорта Dormanred, Новокитаевская и Самарская Плотная. Выжившие клоны (от 2 до 22 для каждого сорта, всего 49) повторно протестировали методом ИФА. Практически все свободные от RBDV растения были получены посредством комплексной терапии. При этом использование рибавирина давало лучшие результаты, по сравнению с РНКазой (соответственно 60 и 25% оздоровленных клонов). Химиотерапия без термообработки оказалась недостаточно эффективна, этим методом удалось оздоровить только 1 растение на среде с РНКазой.
Ключевые слова: RBDV, малина, термотерапия, химиотерапия
Для цитирования: Оздоровление малины от вируса кустистой карликовости (RBDV) методом комплексной терапии в культуре in vitro /О.Ю. Антонова, С.Е. Дунаева, Ю.В. Ухатова, Н.Ю. Камылина, Н.А. Долганова, О.В. Лисицына, Т.А. Гавриленко// Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №7. С. 61-64.
Вирус кустистой карликовости малины - Raspberry bushy dwarf virus (RBDV) - наиболее распространенный патоген дикорастущих и культурных растений рода Rubus [1]. Поражение RBDV приводит к существенному снижению продуктивности и качества урожая малины и ежевики [2]. Вирус широко распространен в Северной и Южной Америке [3, 4], Азии [5, 6], Европе [7-12], Российской Федерации и сопредельных странах [13-16].
В природных условиях RBDV передается от зараженных растений через зараженные клоны и семена, а также с пыльцой, что способствует его быстрому
распространению и делает вирус трудно контролируемым [17]. Для профилактики RBDV рекомендуют использовать высоко устойчивые сорта или высаживать оздоровленные безвирусные растения.
Согласно литературным данным, эффективность оздоровления инфицированных RBDV растений зависит от способа терапии. По сведениям Wang et al. [18] и Wang and Valkonen [19], элиминация этого вируса с использованием только одного метода культуры меристем фактически невозможна, поскольку он способен проникать в меристематические ткани растений. Известно [14] о низкой эффективности оздоровления сортов малины в вариантах с применением химиотерапии in vitro с использованием различных препаратов (рибавирин, азацитидин, дицианамид). Для единичных сортов малины есть сведения об эффективной элиминации RBDV под воздействием химиотерапии с применением салициловой кислоты [20]. Перспективный метод оздоровления растений малины от RBDV - маг-нитотерапия [20, 21].
RBDV относится к термолабильным вирусам, поэтому можно ожидать, что эффективным для оздоровления зараженных растений малины окажется использование методов термотерапии. Однако в литературе имеется противоречивая информация по этому вопросу. Так, по данным Упадышева [20], суховоздушная термотерапия (38оС в течение 30-65 сут.) в сочетании с in vitro культурой апексов размером 0,3-1 мм обеспечивает высокий выход оздоровленных растений (от 60 до 100%). Напротив, Wang et al. [18] не выявили ни одного оздоровленного от RBDV растения при действии различных вариантов термотерапии (38°/26°C - 16/8 ч фотопериод в течение 3-5 недель) в сочетании с in vitro культурой апексов размером 0,2 мм. Эти же авторы отмечают существенное снижение жизнеспособности микрорастений при действии повышенной температуры. Результаты экспериментов Wang et al. [18, 22] свидетельствуют об эффективности использования для оздоровления малины от RBDV криотерапии в сочетании с термотерапией.
Необходимо отметить, что подавляющее число исследований по оздоровлению малины от RBDV выполнено на единичных сортах. Между тем, согласно литературным данным, успех антивирусной терапии зависит от особенностей взаимодействия конкретных генотипов растений и вирусов [18].
Цель нашего исследования - изучение влияния различных методов антивирусной терапии на жизнеспособность сортов малины и эффективность их оздоровления от вируса кустистой карликовости (RBDV) в культуре in vitro.
Условия, материалы и методы. В качестве материала для исследований использовали селекционные сорта малины - образцы из полевой коллекции ВИР (Павловская опытная станция) и in vitro коллекции ВИР. Растения из in vitro коллекции культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга (МС) с половинным составом макросолей и утроенным количеством хелата железа [23, 24].
Детекцию RBDV проводили методом ИФА с использованием набора реактивов фирмы Agdia, включавшего позитивный и негативный контроли. Для тестирования брали листья полевых и in vitro растений; в последнем случае использовали нижние листья развитых микрорастений после 2-3 месяцев культивирования. Растительный материал растирали в жидком азоте до состояния мелкого порошка, добавляли лизирующий буфер и далее следовали протоколу, рекомендованному фирмой-изготовителем [25]. По результатам ИФА отбирали зараженные RBDV пробирочные растения, каждое из которых маркировали и размножали черенкованием (на среде МС ранее указанного состава с добавлением 0,1 мг/л ИМК и 0,1 мг/л гиббереллина) для постановки опытов по оздоровлению.
Оздоровление проводили методами химиотерапии и комплексной терапии (совместное действие термо- и химиотерапии) в четырех вариантах (А-D) опытов. Химиотерапию осуществляли на питательных средах с добавлением рибавирина (Sigma, #R9644-50) в концентрации 30 мг/л (вариант A) или РНКазы (Диа-М, #SRib.0001) в концентрации 0,01% (вариант B); растворы антивирусных реагентов стерилизовали фильтрованием (фильтры Millex-GV, диаметр пор 0,22 мкм). В опытах по химиотерапии верхние
части побегов in vitro-растений длиной одно-два междоузлия без листьев помещали на питательную среду с антивирусными агентами и выдерживали в течение 4 недель на светоустановке при температуре 24-26°/18-20°С, фотопериод - 16/8 ч. У подросших микрорастений повторно отсекали верхние части побегов, переносили их на свежую среду того же состава, и процедуру химиотерапии повторяли. Всего проводили три цикла обработки материала химическими препаратами. В вариантах комплексной терапии микрорастения, культивируемые на питательных средах с рибавирином или РНКазой, в течение 4 недель инкубировали при постоянной повышенной температуре 35°С (соответственно варианты C или D) в камере Barnsted (фотопериод - 16/8 ч). Затем верхние части побегов длиной 1-2 междоузлия переносили на свежую питательную среду того же состава и повторяли термообработку. На третьем этапе растения инкубировали на средах с антивирусными препаратами на светоустановке при 24-26°/18-20°С. Всего при комплексной терапии было проведено два цикла термообработки и три цикла обработки химическими препаратами.
Прошедшие оздоровление микрорастения помещали на питательную среду без антивирусных реагентов и через 2-3 мес. анализировали на присутствие RBDV
Таблица 1. результаты тестирования методом иФА сортов малины из по- методом ИфА.